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大腸桿菌蛋白表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞的制備

更新時(shí)間：2023-10-07

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大腸桿菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用*泛，也是實(shí)惠的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。E. coli具有遺傳背景清楚、細(xì)胞增殖快、表達(dá)量高、穩(wěn)定性好和抗污染能力強(qiáng)等特點(diǎn)，適用于多種屬蛋白的表達(dá)。本文主要講述了大腸桿菌蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)中感受態(tài)細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)流程和原理。

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01
感受態(tài)細(xì)胞的概念

COMPETENT
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感受態(tài)，是指宿主細(xì)胞最容易接受外源基因并實(shí)現(xiàn)將其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)，它是由受體菌的遺傳性狀所決定的，同時(shí)也受菌齡以及外界環(huán)境因子的影響， 比如Ca2+就可以大大促進(jìn)轉(zhuǎn)化的作用。細(xì)胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，新鮮幼嫩的細(xì)胞是制備感受態(tài)細(xì)胞和進(jìn)行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。

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02
感受態(tài)細(xì)胞制備的原理

制備感受態(tài)細(xì)胞的方法是用預(yù)冷的CaCl2處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌，即用低滲CaCl2溶液在低溫（0℃）時(shí)處理快速生長(zhǎng)（進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）的細(xì)菌，從而獲得感受態(tài)細(xì)胞。此時(shí)細(xì)胞膨脹成球形，外源DNA分子在低溫條件下易形成抗DNA酶的羥基－鈣磷酸復(fù)合物粘附在細(xì)胞表面，通過(guò)熱激處理促進(jìn)細(xì)胞對(duì)外源DNA分子的吸收。轉(zhuǎn)化效率非常高。此方法的關(guān)鍵在于選用的細(xì)胞必須處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，實(shí)驗(yàn)操作必須在低溫?zé)o菌環(huán)境下進(jìn)行。



03
大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)


01
實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

  • 儀器：超凈工作臺(tái)，搖床，高壓滅菌鍋，培養(yǎng)箱，制冰機(jī)，超低溫冰箱，離心機(jī)，接種環(huán)，試管，搖瓶（2L），平板，移液槍?zhuān)瑯岊^，離心管(500mL),EP管(1.5mL),藍(lán)蓋瓶，泡沫箱

  • 試劑：CaCl2溶液：PIPES 1.51g，CaCl2•2H2O 4.41g，甘油 75ml，pH=7.0，定容至500ml。

LB培養(yǎng)基（固體、液體）：Tryptone 1.00g，Yeast 0.50g，NaCl 1.00g，定容至100ml。（固體培養(yǎng)基加入1.5%的瓊脂）

抗性：卡那霉素，氨卞青霉素，氯霉素，四環(huán)素。

  • 材料：感受態(tài)菌株


02
實(shí)驗(yàn)方法及操作步驟
  • ?。?0℃凍存的感受態(tài)菌株，用接種環(huán)劃線(xiàn)分離接種于固體平板上（平板抗性根據(jù)感受態(tài)選擇），做好標(biāo)記，倒置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。
  • 第二天，從平板上挑取單個(gè)菌落，接種至含有4ml LB培養(yǎng)液（抗性根據(jù)感受態(tài)選擇）的試管中，37℃,195rpm，震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日取菌液4ml接種至含有400ml LB培養(yǎng)基（抗性根據(jù)感受態(tài)選擇）的2L搖瓶中，37℃，200rpm震蕩培養(yǎng)約2-3小時(shí)。
  • 當(dāng)菌落OD600nm值達(dá)到0.3－0.5時(shí)，將搖瓶取出放置于冰上10-15min。在無(wú)菌條件下把菌液倒入500ml的預(yù)冷的離心管中，離心4℃,3000r，8min。
  • 棄去上清，加入約200ml的預(yù)冷的CaCl2溶液，吹打混勻，懸浮菌體，放入冰浴30min。
  • 離心4℃,3000r，8min，棄去上清，加入約8ml預(yù)冷的CaCl2溶液，重新懸浮菌體。
  • 將用CaCl2溶液處理后的菌體分裝于1.5ml的EP管中，每管110ul，保存于-80℃的超低溫冰箱中。



04
感受態(tài)細(xì)胞測(cè)試

隨機(jī)取1支本次制備的感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化一個(gè)以前轉(zhuǎn)化成功的質(zhì)粒，從轉(zhuǎn)化平板上的菌落數(shù)及表達(dá)鑒定的SDS-PAGE電泳圖(看是否出現(xiàn)其他的雜帶及蛋白表達(dá)情況)判斷感受態(tài)的效價(jià)。如果效價(jià)好，這批感受可以用；否則，要重新制備。


注意事項(xiàng)

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1、每次取感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，注意查看庫(kù)存，保證庫(kù)存不低于15支，少于15支時(shí)要及時(shí)制備。
1、菌株生長(zhǎng)在對(duì)數(shù)時(shí)進(jìn)行CaCl2處理。
2、全程操作要【低溫?zé)o菌】。
3、用CaCl2溶液懸浮菌體時(shí)要均勻，不要有塊狀。
4、常用感受態(tài)細(xì)胞的選擇抗性：BL21（DE3）無(wú)抗性；BL21 Codon plus（DE3）具有氯霉素抗性；OrigamiB（DE3）具有卡那霉素抗性，不能用于具有卡那霉素抗性質(zhì)粒的表達(dá)；BL21（DE3）plysS具有氯霉素抗性；Rosetta（DE3）具有氯霉素抗性；Shuffle具有鏈霉素抗性或不用抗性。